2.材料和方法

2.1.材料

主要构成重构膜外小叶的脂质购自Avanti Polar Lipides（美国阿拉伯斯特市阿拉伯斯特市），并按接收时使用。化合物1-棕榈酰-2-二十二碳六烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（PC（16:0/22:6），分子量=806.1，纯度>99%）和1-（1Z-十八烷基）-2-二十二碳六烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱PC（P-18:0/22:6，分子量=818.2，纯度>99%）作为氯仿溶液（10mg-mL）获得−1).将PC（16:0/22:6）和P-PC（18:0/22:6）的储备溶液稀释至1.25 mg mL−1解决方案。以绵羊毛胆固醇（Chol，Mw=711.0，纯度>98%）和鸡蛋鞘磷脂（SM，Mw=386.7，纯度>98%）为粉末。二者均以1.25 mg/mL的浓度溶解于氯仿（HPLC级，法国瓦尔德鲁伊尔Carlo Erba）−1.

低温保护培养基由Trizma碱（173.0 mM）、一水合柠檬酸（70.0 mM）、果糖（56.0 mM）、甘油（6.4%；v/v）和抗生素（青霉素G钠391 mg L）组成−1，硫酸链霉素856 mg L−1，盐酸林可霉素204 mg L−1，硫酸大观霉素四水合物585 mg L−1）（西格玛-奥尔德里奇，法国圣昆廷法拉维尔）。将pH值调整为6.2，其渗透压约为1300.0 mOsm。

2.2.低密度脂蛋白的提取

根据Moussa等人的方案，从蛋黄中提取低密度脂蛋白（LDL）[31]。提取后，将低密度脂蛋白浓缩提取物（22±0.5 g，相当于8.36 g干低密度脂蛋白）在低温保护介质（100 mL）中稀释。通过micro BCA蛋白质分析试剂盒（Pierce，Thermoscitific，France）对LDL样品中的蛋白质进行定量，得出8.9±1.0 mg-mL−1.LDL样品中PC磷脂的含量是根据鸡蛋中PC的自然比例（18.4 g PC/100 g干LDL）计算得出的，Givenbyonton等人[33]。它等于15.4克升−1份低密度脂蛋白样品。LDL也含有一小部分PE（PC/PE 6:1）[33]。

2.3.精浆收集

从一头Prim Holstein公牛身上收集牛精子，并立即以10000×g离心两次，以回收上清液中的精浆。我们样品的蛋白质含量为88.5±5.0mg-mL−1，由micro BCA蛋白质分析试剂盒（Pierce，Thermoscitific，法国）测定。

2.4.脂质体的制备

脂质体由冷冻保护缓冲液中的卵磷脂提取物通过使用Avanti Polar Lipides（美国阿拉巴马州阿拉巴马州阿拉巴马州阿拉巴马州阿拉巴马州）的微型挤出机挤出而制备。卵磷脂提取物由磷脂酰胆碱（73%）和磷脂酰乙醇胺（11%）以及甘油三酯和鞘磷脂等次要成分组成。提取物在低温保护缓冲液中水合过夜，脂质浓度分别为3.90 mg-mL−1（C1），7.28毫克/毫升−1（C2），14.56毫克/毫升−1（C3）和21.84毫克/毫升−1（C4）。然后在超声波浴中对分散液进行15分钟的超声波处理（Elmasonic S 30H，来自德国Singen Elma，功率为275W）。最后，在挤出机中挤出分散体（20次穿过100 nm的膜）。分布尺寸集中在120nm，Zeta电位值为−6毫伏。在BSP存在下引入的脂质体量以重量表示（脂质体分散体C1、C2、C3和C4分别为1.17 mg、2.18 mg、4.37 mg和6.55 mg的脂质）。不确定度为0.01 mg。

2.5.电泳

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）在还原条件下进行。将精浆溶解在pH值为6.8的缓冲液中，该缓冲液由Tris 0.5 M、SDS 10%、甘油30%w/w和溴酚蓝0.4%组成，以获得1mg mL−1解决方案。添加9%巯基乙醇v/v，并旋转样品，随后在95°C下加热5分钟。然后，将10μL低范围分子量标准品（试剂盒O6U-0511，来自法国Souffelweyrsheim的Euromedex）和10至25μL精浆装载在15%聚丙烯酰胺凝胶（pH 6.8-Tris 0.5 M和SDS 0.10%）上，并与由Tris 0.025 M、甘氨酸0.192 M和SDS 0.1%组成的pH 8.3迁移缓冲液耦合。在20 mA时进行电泳，并用考马斯蓝溶液G250对凝胶进行染色。最后对染色凝胶进行扫描，并使用Multi-Gauge软件（2.0版，日本富士照片胶片有限公司）评估峰值强度。

2.6.表面活性测量

吉布斯膜（由精浆溶液扩散到空气-缓冲界面形成）的表面张力在安装在朗缪尔天平（Microtoul XL-LB，摩登7 Inc.，Helsinki，）上的15孔板（带特氟隆边缘的铝底多孔板）上测量，该天平配有高灵敏度传感器（使用合金丝的Wilhelmy方法）。将该装置置于固定在23°C的温度控制区内，并用纯蒸馏水（美国密理博公司的Milli-Q系统）进行校准。测量精度为0.1 mN/m。将精浆放入第一个孔中，然后在下一个孔中用因子2稀释，依此类推（每个孔的体积为300μL）。每种精浆提取物重复测量4次（n=2）。结果表示为所有测量的平均值。

蛋白质膜的压缩等温线是在之前配备传感器的朗缪尔槽（MicroTour XL-LB，摩登7 Inc.，赫尔辛基）上测量的。精浆首先在冷冻保存缓冲液（1/100）中稀释，并在缓冲液表面逐滴（50μL）扩散。平衡20分钟后，在室温（23°C）下记录压缩等温线。

2.7.精子膜外小叶脂质结构域的重建

精子膜外小叶的脂质结构域如前所述重建[35]。朗格缪尔槽（302LL，NIMA技术，英国）被插入一个自制的手套箱上，放置在抗振动台上，用氩气冲洗，以避免脂质氧化。表面压力的测量精度为0.1 mN/m，使用滤纸制成的一块极板（英国肯特郡迈德斯通惠特曼国际有限公司生产的无灰惠特曼色谱纸）与电子天平相连。环境温度固定在20°C。将所有烧瓶和注射器放入手套箱中，然后用氩气脱气1小时，然后铺展单层。朗缪尔天平的温度由设置为40°C的循环水系统进行恒温控制。缓冲液表面的实际温度为34°C。亚相由低温保护介质组成。将胆固醇、鞘磷脂、P-PC（18:0/22:6）和PC（16:0/22:6）的氯仿溶液以适当的摩尔比（31:14:16:39）用25μL微型注射器（精确到0.5μL）逐滴涂于缓冲液亚相上（Hamilton Bonaduz AG，Bonaduz，Switzterland）。单层保持平衡10分钟，然后以40 cm2/min的屏障速度开始压缩。一旦达到目标压力（25 mN/m），通过调整可移动屏障的表面积保持压力恒定。由于单分子层在30 mN/m时不够稳定，这是与双层中脂质堆积密度相关的膜压力[36]，我们将目标压力降低到25 mN/m，其中单分子层更稳定（见结果）。

一旦达到目标压力（25 mN/m），将其保持1000 s，然后使用弯曲针管将生物分子（LDL、BSP或脂质体）溶液引入亚相。针头弯曲远离针尖，并位于槽的底部，以便在压缩的亚相下方进行注射。之前将当量体积（每种添加剂0.3 mL）移到屏障后面。注射生物分子后，监测每个脂质分子的面积变化，并表示为相对于初始值的变化（a/a=（a−A（t0）×100/A（t0）。它已经被跟踪了3000秒，相当于冷冻保存前处理精液的时间。在这种恒压模式下，生物分子插入脂质单层导致膜压力增加，而膜压力通过增加表面积而降低。相反，如果生物分子导致脂质单层溶解在亚相中，则表面积减小。重复所有数据，偏差不超过表面积的5%。

2.8.低温透射电子显微镜（Cryo TEM）

使用低温插入式低温固定装置（美国加坦）制备用于低温TEM观察的试样，其中一滴水悬浮液沉积在辉光放电多孔型碳涂层格栅（美国Ted Pella公司）上。然后，通过将含有试样的液滴吸干到支撑碳膜孔上残留的薄层液体上，制备TEM网格。通过将格栅快速插入液氮冷却的液态乙烷中，使液膜玻璃化。玻璃化标本安装在Gatan 910标本架（美国Gatan）中，使用CT-3500-cryotransfer系统（美国Gatan）将其插入显微镜中，并用液氮冷却。然后从保存在玻璃质冰中并悬浮在支撑碳基质上的孔中的标本获得TEM图像。

在低剂量条件下观察样品（<10 e−/A2），在−178°C，使用JEM 1230“Cryo”显微镜（日本Jeol），在80 kV下运行，并配备LaB6灯丝。所有显微照片均记录在Gatan 1.35K×1.04K×12位ES500W CCD相机上。为确保观察的良好重复性，从几个样品制备中采集了一系列超过50张的图像，放大率不同。